題目：不同年齡軟骨ECM對(duì)BMSC體外和體內(nèi)軟骨生成的影響

（如果需要完整文獻(xiàn)請(qǐng)與我們工作人員聯(lián)系，可試樣）

1. 簡(jiǎn)介

基于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的生物材料通過模擬天然微環(huán)境來調(diào)節(jié)沒有外源性生長(zhǎng)因子的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的軟骨分化，是軟骨組織工程的有希望的候選者。ECM支架的生物學(xué)特性主要取決于原始來源，這將直接影響ECM材料的軟骨作用。盡管近年來對(duì)ECM支架的研究不斷擴(kuò)大，但優(yōu)化的ECM材料在軟骨再生中的選擇較少報(bào)道。在這項(xiàng)研究中，我們收獲并比較了新生兒、幼年和成年兔的關(guān)節(jié)軟骨ECM。結(jié)果表明，不同年齡ECM在脫細(xì)胞前后的機(jī)械強(qiáng)度、硫酸化糖胺聚糖和膠原蛋白含量存在顯著差異。因此，三種基于ECM的膠原蛋白水凝膠顯示出不同的組成和機(jī)械性能，它們發(fā)揮了年齡依賴性軟骨誘導(dǎo)性?？偟膩碚f，體外和體內(nèi)結(jié)果表明，新生兒ECM促進(jìn)BMSCs的軟骨形成最多，但導(dǎo)致嚴(yán)重的基質(zhì)鈣化。相比之下，BMSCs通過成人ECM合成了最少量的軟骨基質(zhì)，鈣化最小。幼年ECM在促進(jìn)BMSC軟骨生成和預(yù)防基質(zhì)鈣化方面取得了總體效果?？傊@項(xiàng)研究為我們目前在設(shè)計(jì)未來基于ECM的生物材料以成功修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨方面的知識(shí)提供了重要信息。

2.材料和方法

機(jī)械評(píng)估

使用納米壓頭確定每個(gè)樣品的力學(xué)評(píng)估（Piuma，Optics11，荷蘭）。有效楊氏模量通過數(shù)據(jù)擬合以下參數(shù)計(jì)算得出： 探頭剛度 4.3 （N m?1);半徑 51.0 μm。

機(jī)械測(cè)試

使用動(dòng)態(tài)機(jī)械分析儀，在室溫下測(cè)定膠原蛋白水凝膠和三種不同膠原蛋白-DCP復(fù)合水凝膠（Φ 8 mm×h 2.5 mm）的儲(chǔ)存和損耗模量，并在多頻模式（1-5 Hz）下測(cè)量其機(jī)械性能。

不同年齡兔天然軟骨組織的比較

含水量和機(jī)械強(qiáng)度

首先比較了新生、幼年或成年兔的原生軟骨組織的差異。3日齡兔軟骨組織中的含水量（圖1A）顯著高于其他兩個(gè)樣品。100天和200天之間的含水量沒有顯著差異。有效楊氏模量測(cè)定的力學(xué)性能表明，軟骨組織的機(jī)械強(qiáng)度隨年齡的增長(zhǎng)而增加，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1

表征來自新生兒、幼年或成年兔的天然軟骨組織。（A）含水量（左）和機(jī)械強(qiáng)度（中）。（B）DNA，sGAG和總膠原蛋白含量（n = 3）。ns 表示 P > 0.05，* 表示 P < 0.05，** 表示 P < 0.01，*** 表示 P < 0.001。

DNA、sGAG 和總膠原蛋白的定量

通過定量DNA含量來評(píng)估新生、幼年或成年兔軟骨組織中的細(xì)胞密度（圖1B），其隨著年齡的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。3天樣本的DNA含量明顯較高，為14 371 ng/mg±480 ng/mg，是其他兩個(gè)樣本的四倍多。100天樣品中的DNA含量為3325 ±220 ng/mg，高于200天樣品中的2588 ±410 ng/mg，但這種差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3個(gè)不同組的sGAG含量遵循相同的DNA趨勢(shì)，在3天、100天和200天樣品中分別為184.17±12.30、117.87±2.97和110.57±2.61 μg/mg。3 天樣本中的 sGAG 值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于其他兩個(gè)樣本，但 100 天和 200 天樣本之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相比之下，3組總膠原蛋白含量的DNA和sGAG值呈逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)，其中200天樣品的最高值為855.51±38.14 μg/mg，其次是100天樣品中的753.53 ±27.69 μg/mg和3 d樣品中的629.10 ± 19.68 μg/mg。值得注意的是，所有組間總膠原蛋白含量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

機(jī)械性能和降解

通過儲(chǔ)能模量（圖3B）和損耗模量（圖3C）表征了水凝膠的力學(xué)性能，它們分別代表了水凝膠的彈性和粘度。一般來說，膠原蛋白水凝膠的儲(chǔ)存量和損耗模量，并且隨著DCP的摻入而增加。此外，隨著老兔的DCPs的加入，復(fù)合水凝膠的存儲(chǔ)模量和損耗模量均進(jìn)一步增加。結(jié)果，四種水凝膠的總儲(chǔ)存和損耗模量遵循膠原蛋白-200d>膠原蛋白-100d>膠原蛋白-3d>膠原蛋白的順序。4種水凝膠在膠原酶溶液中的降解速率如圖.3D所示。一般來說，膠原蛋白水凝膠具有較高的降解速率，在19 h內(nèi)降解。相比之下，3種膠原蛋白-DCP復(fù)合水凝膠的降解曲線相似，24 h時(shí)膠原蛋白-3d、膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d水凝膠的降解率分別為95.56%、92.20%和93.07%。

討論

當(dāng)使用天然軟骨組織作為原材料來制造ECM支架時(shí)，了解軟骨組織的內(nèi)在特性非常重要，因?yàn)檫@可以為進(jìn)一步優(yōu)化ECM材料的選擇提供關(guān)鍵信息。本研究旨在表征新生、幼年或成年兔的脫細(xì)胞軟骨ECM，以及它們?cè)?1天體外培養(yǎng)和28天體內(nèi)植入中對(duì)BMSCs軟骨分化和軟骨ECM合成的影響。據(jù)我們所知，這是第一項(xiàng)直接比較由不同年齡的軟骨組織制成的ECM支架的研究，以及不同年齡的去細(xì)胞化組織的內(nèi)在特性如何影響ECM支架的特性，這進(jìn)一步影響其軟骨生成性能，以實(shí)現(xiàn)成功的軟骨再生。我們的研究提出了幾個(gè)值得注意的發(fā)現(xiàn)，即由三種不同年齡的軟骨組織制成的ECM支架的軟骨生成作用。結(jié)果表明，3個(gè)不同年齡軟骨組織ECM支架的機(jī)械強(qiáng)度、sGAG和總膠原蛋白含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，影響3個(gè)樣品的細(xì)胞增殖和分化。詳細(xì)的生化和基因分析表明，由較年輕的軟骨組織制成的ECM支架導(dǎo)致BMSCs更好的軟骨形成，但不幸的是，新生兒軟骨組織也會(huì)導(dǎo)致不需要的組織鈣化。

首先比較了新生（3天）、幼年（100天）和成年（200天）兔關(guān)節(jié)軟骨組織的成分和力學(xué)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3天軟骨組織中的DNA和sGAG含量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于100天和200天樣品[26，27]。sGAG是帶負(fù)電荷的多糖，可結(jié)合并保留水和水溶性分子[28]。因此，樣本的sGAG含量與其含水量相關(guān)，在3 d樣品中最高，并隨年齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)[29]。相比之下，關(guān)節(jié)軟骨中的總膠原蛋白含量隨兔子年齡的增長(zhǎng)而增加[30]。膠原蛋白是軟骨組織中結(jié)構(gòu)的大分子，主要抵抗應(yīng)激[31]。因此，軟骨組織的總膠原蛋白含量與機(jī)械強(qiáng)度一致，并隨年齡增長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)。去細(xì)胞化手術(shù)有效去除了不同年齡的所有軟骨組織中99%以上的dsDNA，并且dsDNA濃度均低于<50ng/mg干重的臨界脫細(xì)胞水平[10]。由于ECM中的sGAG通過弱分子間相互作用（例如非共價(jià)鍵）連接到膠原纖維網(wǎng)絡(luò)[32]，這在脫細(xì)胞過程中很容易中斷。因此，只有25-30%的sGAG在去細(xì)胞化后仍留在DCP中。相比之下，脫細(xì)胞后所有3個(gè)DCP的總膠原蛋白含量幾乎保持不變，表明去細(xì)胞化過程不會(huì)導(dǎo)致膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的降解或去除，并保留了軟骨組織的基本結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果也與之前的研究一致[9，33]。3種不同年齡軟骨組織的DCPs隨年齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，總膠原蛋白含量呈上升趨勢(shì)。經(jīng)過相同的研磨過程，具有較高機(jī)械強(qiáng)度的軟骨組織導(dǎo)致軟骨組織顆粒的晶粒尺寸較大。因此，3 天 DCP 最小，200 天 DCP 的晶粒尺寸最大。雖然大小差異不影響去細(xì)胞化的有效性，但它可能會(huì)影響DCP上的細(xì)胞附著和行為[34]。

3個(gè)ECM支架，分別命名為膠原蛋白-3d、膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d水凝膠，由不同年齡的膠原蛋白水凝膠和不同年齡的不同DCP混合制成。SEM圖像表明，膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)在所有樣品中都保存良好，單個(gè)DCP被困在膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)中。因此，單個(gè)膠原蛋白-DCP水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度受添加DCP的影響，3個(gè)水凝膠的儲(chǔ)存和損耗模量遵循膠原蛋白-200d>膠原蛋白-100d>膠原蛋白-3d的順序。當(dāng)用BMSCs培養(yǎng)時(shí)，額外的DCPs在體外也延遲了水凝膠的降解并減少了其收縮，并且在體外和體內(nèi)均顯示出BMSCs的軟骨分化和sGAG合成在體外和體內(nèi)的年齡依賴性性能。膠原蛋白-3d水凝膠實(shí)現(xiàn)的軟骨形成最多，其次是膠原蛋白-100d，膠原蛋白-200d最少。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了來自新生兒、幼年或成年兔的ECM支架會(huì)導(dǎo)致BMSCs產(chǎn)生不同的軟骨誘導(dǎo)性。這可能是由于許多因素的組合。首先，由于較年輕樣本中的sGAG濃度較高，更多的sGAG能夠在來自年輕兔子的ECM支架中保留。天然軟骨ECM富含GAG，主要由透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)鹽和硫酸乙酰肝素組成。到目前為止，許多研究已經(jīng)證實(shí)了它們?cè)谡{(diào)節(jié)軟骨形成方面的功能[35]，并且在生物材料中添加GAG可以促進(jìn)干細(xì)胞的軟骨分化。因此，較年輕的DCP中較高的sGAG含量將有利于BMSC的軟骨形成。此外，由于年輕軟骨組織的機(jī)械強(qiáng)度較低，來自年輕兔的DCPs晶粒尺寸較小，在膠原蛋白-DCP復(fù)合水凝膠中的分散均勻。據(jù)報(bào)道，當(dāng)與BMSC混合時(shí)，較小的ECM顆粒可以增強(qiáng)細(xì)胞-材料相互作用，并提高軟骨ECM衍生支架的誘導(dǎo)能力[36]。此外，水凝膠的力學(xué)性能也影響B(tài)MSCs的軟骨形成。 由于隨著兔齡的增長(zhǎng)，DCPs的機(jī)械強(qiáng)度增加，膠原蛋白-DCP水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度也隨之增加。卞等.[37]發(fā)現(xiàn)，與高交聯(lián)結(jié)構(gòu)相比，機(jī)械強(qiáng)度較低的低交聯(lián)密度水凝膠更有利于軟骨基質(zhì)的形成。然而，當(dāng)利用BMSC在體外和體內(nèi)進(jìn)行軟骨再生時(shí)，組織鈣化是一個(gè)常見問題[38，39]。 在這項(xiàng)研究中，在膠原蛋白和膠原蛋白-3d樣品中發(fā)現(xiàn)了這個(gè)問題，可能是由于不同的原因。膠原蛋白水凝膠在體內(nèi)的組織礦化是由于其快速降解特性導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)支撐的喪失，因此無(wú)法在新組織結(jié)構(gòu)形成之前維持軟骨形成表型[40]。相比之下，膠原蛋白-3d的降解率遠(yuǎn)低于膠原蛋白，幾乎與膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d相同。在這種情況下，膠原蛋白-3d誘導(dǎo)的組織鈣化可能是由于其內(nèi)在特性。由于軟骨是骨骼生長(zhǎng)的模板。胚胎階段為骨骼發(fā)育[41]，該階段的軟骨ECM也會(huì)影響培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)育并誘導(dǎo)BMSC的成骨。 因此，源自新生兒ECM的膠原蛋白-3d支架繼承了這一功能并導(dǎo)致再生基質(zhì)的鈣化。相比之下，膠原蛋白-100d和膠原蛋白-200d支架來源于幼年和成人ECM，不再涉及軟骨內(nèi)骨形成過程，也不利于BMSC的成骨分化。在這一發(fā)現(xiàn)的背景下，進(jìn)一步比較發(fā)育生物學(xué)中不同年齡的軟骨組織之間的詳細(xì)組成和生物學(xué)差異將是有趣的。

結(jié)論

在這項(xiàng)研究中，收獲了來自新生兒、幼年和成年兔的關(guān)節(jié)軟骨組織并進(jìn)行去細(xì)胞化。脫細(xì)胞前后3個(gè)陳年樣品的機(jī)械強(qiáng)度、sGAG和膠原蛋白含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，由不同年齡的不同DCP制成的復(fù)合水凝膠表現(xiàn)出年齡依賴性軟骨誘導(dǎo)性。一般來說，新生兒DCP促進(jìn)BMSCs的軟骨形成最多，但導(dǎo)致嚴(yán)重的基質(zhì)鈣化。相比之下，幼年和成年DCP的軟骨基質(zhì)產(chǎn)生較少，但沒有觀察到可見的成骨作用?？傊鼜?qiáng)調(diào)了在軟骨組織工程中使用天然軟骨組織制造ECM支架時(shí)年齡差異的重要性。盡管新生兒樣本具有最佳的成骨作用，但它也顯示出明顯的成骨作用，這將是限制其在軟骨再生中應(yīng)用的關(guān)鍵缺點(diǎn)。相比之下，幼年樣本在促進(jìn)BMSCs軟骨生成和抑制成骨方面取得了總體效果。因此，青少年ECM可能是比新生兒和成人ECM更好的來源。這些發(fā)現(xiàn)為我們目前在設(shè)計(jì)未來基于ECM的生物材料以成功修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨方面的知識(shí)提供了重要信息。

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